Zeitstrukturen endokriner Systeme

Einfluss von Melatonin auf die Insulinsekretion pankreatischer Inseln

1. Die Insulinsekretion erfolgt im in vitro-Experiment circadian-rhythmisch
Erstmalig konnte unter Nutzung superfusionstechnischer Techniken [Peschke et al., 1997; Csernus et al., 1998] nachgewiesen werden, dass die Insulinsekretion der pankreatischen β-Zelle auch im in vitro-Versuch circadian-rhythmisch erfolgt [Peschke und Peschke, 1998]. Ferner wurde auf Grund umfangreicher Experimente deutlich, dass die Rhythmik in der pankreatischen Insel selbst generiert wird, wir es also mit einem peripheren Oszillator zu tun haben, der neben dem zentralen hypothalamischen Schrittmacher Nucleus suprachiasmaticus für die Rhythmik der Insulinsekretion pankreatischer Inseln bedeutungsvoll ist. Weiterführende Untersuchungen haben ergeben, dass in der Insel nicht nur Uhrengene wie Per1, Per2, Bmal1, Clock, Tim und Cry1 sowie das output-Gen Dbp exprimiert werden, sondern dass die genannten Genaktivitäten überwiegend circadian-rhythmisch oszillieren [Mühlbauer et al., 2004; Mühlbauer und Peschke, 2005].
Weiterführende Experimente sollen klären, ob genannte Uhrengene direkt oder auch indirekt über Kaliumkanäle (Erg, Kir6.2/Sur1) die circadian-rhythmische Insulinsekretion steuern [Mühlbauer und Peschke, 2007; Mühlbauer et al., 2007]. Die Kenntnis dieses Sachverhaltes, eingeschlossen die daraus folgende Möglichkeit, Einfluss auf die Insulinsekretion zu nehmen, könnte künftig klinische Bedeutung erlangen, da Rhythmusstörungen und Desynchronisationen von Krankheitswert sind.

2. Die pankreatische β-Zelle verfügt über Melatonin-Rezeptoren
Zunächst konnte von der Arbeitsgruppe nur der Melatoninrezeptor MT1 nachgewiesen werden [Peschke et al., 2000, 2002; Peschke, 2003, 2004]. Später gelang unter Nutzung eines veränderten Primer-Designs auch der Nachweis des MT2-Reptors auf der pankreatischen β-Zelle [Mühlbauer und Peschke, 2007; Peschke et al., 2007; Peschke, 2008]. Die Nachweise wurden inzwischen an Ratten-Insulinomazellen INS1, isolierten Ratten-Inseln als auch Pankreasgewebe von Ratte und Mensch validiert. Die Rezeptorergebnisse und Publikationen wurden 2009 unter Zitierung unserer Erstbeschreibung in verschiedenen „Nature genetics“-Publikationen berücksichtigt [u.a. Prokopenko et al.: Variants in MTNR1B influence fasting glucose levels, Nat. Genet. 2009; 41. 77–81; Bouatia-Naji et al.: A variant near MTNR1B is associated with increased fasting plasma glucose levels and type 2 diabetes risk, Nat. Genet. 2009; 41. 89–94; Lyssenko et al.: Common variant in MTNR1B associated with increased risk of type 2 diabetes and impaired early insulin secretion, Nat. Genet. 2009; 41: 82–88].

3. Der Rezeptor-mediierte Einfluss von Melatonin auf die Insulinsekretion erfolgt in der pankreatischen β-Zelle unter Nutzung unterschiedlicher Signalwege
Im Ergebnis der eigenen Untersuchungen konnte der Einfluss von Melatonin auf die pankreatische β-Zelle und damit auf die Insulinsekretion im Rahmen der Projektarbeit aufgeklärt werden. Dazu kann festgestellt werden, dass auf Grund superfusionstechnischer, molekularbiologischer, konfokal- und elektronenmikroskopischer sowie immunhistochemischer und radioimmunologischer Ergebnisse nachgewiesen werden konnte, dass Melatonin in der pankreatischen β-Zelle (Modell: Ratten-Insulinoma-Zelllinie INS1) über die cAMP- sowie cGMP-Signalkaskade die Insulinsekretion hemmt, auf dem Weg der IP₃-Kaskade die Insulinsekretion jedoch steigert [Übersichten: Peschke, 2008; Peschke und Mühlbauer, 2010; Bach und Peschke, 2012].
Beide Effekte werden über MT₁- und MT₂-Rezeptoren vermittelt (funktionelle, autoradiographische, immunologische und molekularbiologische Nachweise). Unter dem Einfluss der kompetitiven Melatoninrezeptor-Blocker Luzindol und 4P-PDOT werden die Wirkungen von Melatonin nahezu aufgehoben. Forskolin stimuliert dosisabhängig die Insulinsekretion von INS1-Zellen über eine intrazelluläre cAMP-Freisetzung, die durch gleichzeitige Melatonin-Gabe reduziert wird. Die hemmende Melatoninwirkung auf die cAMP-Signalkaskade ist mit dem G_i-Protein-Inhibitor Pertussistoxin (PTX) aufhebbar. Offenbar ist sowohl der cAMP- als auch der cGMP-senkende – und folglich die Insulinsekretion hemmende – Einfluss von Melatonin stärker als der IP₃-liberierende – die Insulinsekretion steigernde – Einfluss. Erst unter Blockierung der cAMP-Signalkaskade mit PTX (Gi-Protein-Blockierung) zeigt sich ein stimulierender Einfluss von Melatonin auf die IP₃-Signalkaskade. Die gleichzeitige Nutzung antagonistischer Signalkaskaden durch Melatonin ist nicht ungewöhnlich. Bei der Einordnung in den physiologischen Kontext ist der Zeitfaktor bedeutungsvoll. Die volle Ausprägung der cAMP-inhibierenden Wirkung von Melatonin verlangt eine Präinkubation, während die IP₃-stimulierende Wirkung sofort eintritt. Melatonin wird an der pankreatischen β-Zelle unter anderem eine Funktion als circadianer Synchronisator zuerkannt. Charakterisierung der 3 Signalwege, die Melatonin zur Beeinflussung der Insulinsekretion nutzt:

1. Signalweg: Melatonin – MT-Rezeptoren – G_i-Proteine – Adenylatzyklase – cAMP [Peschke et al., 2000, 2002; Peschke und Mühlbauer, 2005]
2. Signalweg: Melatonin – MT-Rezeptoren – Guanylatzyklase – cGMP [Stumpf et al., 2008, 2009]
3. Signalweg: Melatonin – MT-Rezeptoren – G_q-Proteine – Phospholipase C – IP₃ [Bach et al., 2005; Peschke et al., 2006; Peschke und Mühlbauer, 2007]
   
   

5. Untersuchungen zum Einfluss von Melatonin auf die Insulinsekretion der pankreatischen β-Zelle, Insulin-Melatonin-Antagonismen bei Typ1- und Typ2-Diabetes
Schließlich können erste klinische Befunde mitgeteilt werden, die in jüngerer Zeit die Arbeit der Projektgruppe nachhaltig bestimmt haben. Zurückblickend fällt auf, dass die Diskussion um veränderte Melatonin-Plasmaspiegel im Zusammenhang mit diabetischer Stoffwechselentgleisung über Jahrzehnte kontrovers geführt wurde. Wir konnten bei Untersuchungen im Tagesverlauf nachweisen, dass – im Vergleich zu metabolisch gesunden Individuen – Typ2-diabetische Erwachsene ebenso wie Typ2-diabetische Goto-Kakizaki(GK)-Ratten durch verringerte Melatonin-Plasmaspiegel auffällig werden [Peschke et al., 2006, 2007; Frese et al., 2007, Peschke, 2008]. Zur Bestimmung der Melatonin-Plasmaspiegel wurden 6 Wochen alte GK- und Wistar-Ratten in 3h-Intervallen unter definierten Beleuchtungsverhältnissen (L:D = 12:12, Licht an: 7.00 Uhr) getötet. Mittels real-time RT-PCR wurden die tagesrhythmische Expression der MT₁-Rezeptor-mRNA im Pankreas, der Arylalkylamin-N-acetyltransferase (AANAT)-mRNA (Schlüsselenzym der Melatoninsynthese) und der Insulin-Rezeptor(InsR)-mRNA im Pinealorgan untersucht. Zusätzlich wurde die pineale AANAT-Aktivität im Tagesverlauf mit einem ¹⁴C-Assay bestimmt. Die AANAT-Aktivität ist bei GK-Ratten vermindert. Ferner gelang es erstmalig, die Expression von InsR-mRNA im Pinealorgan nachzuweisen. Die AANAT-mRNA wird bei erhaltenem Tagesrhythmus vermehrt exprimiert, ebenso wie die Expression der MT1-Rezeptor-mRNA im Pankreas der GK-Ratte erhöht ist. GK- und Wistar-Ratten erreichen das Maximum der Expression von AANAT-mRNA sowie MT₁-Rezeptor-mRNA in der Mitte der Dunkelzeit.
Um nachweisen zu können, an welcher Stelle der Melatoninsynthese bei Typ2-diabetischen Tieren der Schaden gesetzt wird, wurden bei 8 und 50 Wochen alten Wistar- und GK-Ratten neben Melatonin auch seine Precursor (Tryptophan, 5-hydroxytryptophan, Serotonin und N-acetylserotonin) Mitte der Licht- und Dunkelzeit HPLC-technisch quantifiziert. Zusätzlich wurden die Melatonin-synthetisierenden Enzyme, der pineale Noradrenalin-Gehalt und der pineale Proteingehalt bestimmt. Es zeigt sich, dass die Epiphysen Typ2-diabetischer Ratten charakteristische Abweichungen aufweisen, die folgendermaßen zusammengefasst werden können: (1.) veränderte Aktivitäten der Melatonin-synthetisierenden Enzyme, (2.) verringerte Precursor der Melatoninsynthese und (3.) verringerte Noradrenalinspiegel während der Nacht, was die erniedrigte Melatonin-Synthese erklären würde (Frese et al., 2009). In der Folgezeit konnten diese Ergebnisse durch Gewinnung von Tagesprofilen erweitert und validiert werden [Bach et al., 2010]. In einem weiteren Versuch wurden hohe Mengen von Melatonin normoglykämischen Wistar- und Typ2-diabetischen GK-Ratten oral verabreicht („Trinkmodell“). Im Ergebnis ließ sich in Ergänzung zu früher durchgeführten in vitro-Superfusionsexperimenten nachweisen, dass auch im Tierversuch Melatonin die Insulinkonzentration im Blut senkt. Durch diesen Versuch konnten somit die bisherigen in vitro-Befunde untermauert werden [Peschke et al., 2010].
Von Bedeutung waren zusätzlich Untersuchungen an Typ1-diabetischen Ratten, die bei stark erniedrigtem oder fehlendem Insulin erhöhte Melatonin-Plasmaspiegel aufwiesen, also in Umkehrung wiederum einen Insulin-Melatonin-Antagonismus zeigten [Peschke et al. 2008, 2011, 2012]. In überzeugender Weise konnte weiterhin gezeigt werden, dass nach Insulinsubstitution sich nicht nur die Insulin-, sondern ebenfalls die Melatonin-Spiegel normalisierten. Diese und weitere Befunde haben in Einheit mit umfangreichen Katecholamin-Bestimmungen zu der Überzeugung geführt, dass die Katecholamine für das beschriebene antagonistische Verhalten von Insulin und Melatonin verantwortlich zu machen sind [Übersicht siehe Peschke et al., 2012]. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass Typ 2-Diabetiker erniedrigte Katecholamin- und Melatonin-Spiegel, Typ 1-Diabetiker hingegen erhöhte Katecholamin- und Melatonin-Spiegel aufweisen. Als Erklärung wird angenommen, dass die Katecholamin-Spiegel den Schlüssel für das Verständnis der Gegensinnigkeit darstellen, weil die Melatoninsynthese durch Katecholamine entscheidend gesteigert wird.

6. Untersuchungen zum Einfluss von Melatonin auf die Glukagonsekretion der pankreatischen α-Zelle
Neben den beschriebenen β-Zell- und Insulin-Untersuchungen haben molekularbiologische und zellphysiologische Versuche den Nachweis erbracht, dass auch Glukagon-produzierende pankreatische α-Zellen (α-Zelllinie αTC1.9) Melatoninrezeptoren (MT1 und MT2) exprimieren [Bähr et al., 2011]. Durch die Melatoninrezeptor-Expression sowie ihre Glukose- und Insulin-Responsivität stellte die Glukagon-produzierende αTC1.9-Zelllinie ein geeignetes Zellmodell für Analysen zur Melatoninwirkung auf die Glukagonsekretion dar. Die Ergebnisse von Inkubationsexperimenten mit αTC1.9-Zellen zeigten erstmals, dass Melatonin sowohl die Expression als auch die Sekretion von Glukagon signifikant erhöht [Bähr et al., 2011]. Durch Vorinkubation mit Melatoninrezeptor-Antagonisten wurde die Glukagon-erhöhende Wirkung von Melatonin aufgehoben. Damit konnte nachgewiesen werden, dass es sich um einen Rezeptor-spezifischen Effekt handelt. Zusätzlich wurden Untersuchungen zur Beteiligung spezifischer Signalkaskaden durchgeführt: Eine Ko-Inkubation mit Pertussistoxin bewirkte keine Aufhebung des Glukagon-steigernden Melatonineffektes. Zudem kam es durch Melatonininkubation zu keiner Änderung der cAMP-Konzentration in den αTC1.9-Zellen. Somit konnte eine Beteiligung Gα_i- und Gα_s-gekoppelter Proteine ausgeschlossen werden. Demgegenüber bewirkten Blockierung der Phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) sowie der Einsatz eines Phospholipase C-Inhibitors eine Hemmung der Melatoninwirkung bei αTC1.9-Zellen [Bähr et al., 2012]. Dies führte zu der Einsicht, dass Melatonin seine Effekte in der pankreatischen α-Zelle über Gα_q-gekoppelte sowie PI3K-abhängige Signalwege vermittelt. Ferner wurden Untersuchungen an isolierten Langerhansschen Inseln verschiedener Tiermodelle durchgeführt. Sowohl in Inseln stoffwechselgesunder als auch Typ2-diabetischer Ratten erhöhte Melatonin die Glukagonsekretion statistisch signifikant. Ebenso wurde bei Inkubationsversuchen an Inseln von Melatoninrezeptor-knockout-Mäusen gegenüber Wildtyp-Mäusen eine signifikant verminderte Glukagonsekretion nachgewiesen. Damit konnte gezeigt werden, dass Melatonin auch im Zellverband des endokrinen Pankreas die Glukagonfreisetzung Rezeptor-vermittelt erhöht [Bähr et al., 2012].
Durch Studien an Melatonin-behandelten Ratten und Melatoninrezeptor-knockout-Mäusen konnte die Wirkung des Indolamines auf die Glukagonsekretion auch in vivo bestätigt werden, da Melatonin-substituierte stoffwechselgesunde Ratten gegenüber der Kontrollgruppe signifikant erhöhte Plasma-Glukagonkonzentrationen aufwiesen. Bei Typ2-diabetischen Tieren war das Plasma-Glukagon gegenüber dem stoffwechselgesunder Kontrolltiere signifikant erhöht. Melatoninsubstitution führte bei Typ2-diabetischen Ratten jedoch zu einer leichten Erniedrigung der Plasma-Glukagonkonzentration. Zudem wurde nachgewiesen, dass die hepatische Glukagonrezeptor-Expression nach Melatoninsubstitution bei stoffwechselgesunden Ratten signifikant erhöht und bei Typ2-diabetischen Ratten erniedrigt war – möglicherweise eine kompensatorische Regulierung der veränderten Glukagon-Plasmaspiegel [Bähr et al., 2011]. Schließlich konnte nachgewiesen werden, dass die Glukagonkonzentration im Plasma von Melatoninrezeptor-knockout-Mäusen in Vergleich zu Kontrolltieren signifikant erniedrigt und die Expression des Glukagonrezeptors in der Leber bei Mäusen mit Melatoninrezeptor-knockout signifikant erhöht waren [Bähr et al., 2012]. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass Melatonin die Glukagonsekretion Rezeptor-abhängig steigert und Einfluss auf die periphere Wirkung von Glukagon nimmt.

7. Gentechnische Melatoninrezeptor-Untersuchungen an INS1-β-Zellen
Das Indolamin Melatonin übt, wie oben beschrieben, seine zellulären Wirkungen über zwei membranständige Rezeptor-Isoformen, nämlich den MT1 (Mel1a) und den MT2 (Mel1b) aus, wobei die Kenntnisse über die Melatonin-vermittelten Effekte dieser Rezeptoren in der pankreatischen β-Zelle und die jeweilige Bedeutung für das Signalgeschehen und die Insulinsekretion noch lückenhaft sind. Um näheres über die Bedeutung des MT2–Rezeptors für die β-Zelle und die an diese Isoform geknüpften Signalkaskaden zu erfahren, wurde als Zellmodell die Ratteninsulinoma-Zelllinie INS1 genutzt. Es gelang mittels gentechnischer Methoden, in dieser Glukose-responsiven β-Zelllinie den humanen MT2 (hMT2) Rezeptor stabil zu exprimieren [Mühlbauer et al., 2011]. Einige genetische Varianten dieser Rezeptor-Isoform waren kurz zuvor durch mehrere internationale Assoziationsstudien mit Typ2-Diabetes in Verbindung gebracht worden (siehe oben). Melatonin senkte in Zellen mit hMT2-Expression die Insulinsekretion stärker als in der genetisch unveränderten Ausgangslinie, was als Indiz für eine funktionelle Kopplung des hMT2 Rezeptors an inhibitorische GTP-bindende Proteine (Gi-Proteine) gewertet werden kann. Die Analytik der mit dem Rezeptortyp MT2 verknüpften Signalkaskaden zeigte zum einen, dass Melatonin über hMT2-Rezeptoren hemmend auf den „second messenger“ cyclisches Adenosinmonophosphat (cAMP) wirkt, zum anderen aber auch gleichzeitig, wenn auch in geringerem Ausmaß, auf cGMP. Die Aktivierung beider Kaskaden über Gi-Proteine führte insgesamt zu einer Verminderung der Insulinsekretion. Die Bedeutung von Gi-Proteinen für die Hemmung der Insulinsekretion konnte durch Präinkubation der INS1-Zellen mit dem Gi-Protein-Blocker Pertussistoxin nachgewiesen werden.
Um darüber hinaus weitere Informationen zur Funktionsbedeutung der Rezeptorisoformen in der INS1-Zelle (als Modell einer nativen β-Zelle) zu erlangen, wurde im Zuge eines zweiten Projektes durch RNA-Interferenz (RNAi) die Expression des MT1-Rezeptors auf Transkriptebene supprimiert [Mühlbauer et al., 2012]. Zellen einer dergestalt gentechnisch modifizierten, klonalen INS1-Linie wiesen phänotypisch einen stark gesenkten Besatz mit MT1-Rezeptoren auf. Funktionelle Experimente mit Melatonin bei diesen Zellen mit MT1-„knockdown“ belegten, dass über den MT1-, nicht aber über den MT2-Rezeptor die entscheidende Hemmung der Insulinsekretion vermittelt wird. Zudem konnte der Nachweis erbracht werden, dass der MT1-Rezeptor der β-Zelle mit der cAMP-Kaskade über Hemmung der Phosphorylierung des Transkriptionsfaktors CREB, nicht aber mit cGMP verknüpft ist. Dieser Befund konnte an isolierten Inseln von Mauslinien mit funktioneller Deletion („knockout“) des MT1, des MT2 oder beider Rezeptoren gleichzeitig, erhärtet werden. Inseln mit einem „knockout“ des MT1, oder „knockout“ beider Isoformen gleichzeitig, nicht aber solche des Wildtyps oder solche mit „knockout“ der MT2 Isoform, vermochten die inhibierende Melatoninwirkung aufzuheben. Daraus lässt sich folgern, dass die hemmenden Melatonineffekte auf die Insulinsekretion primär über MT1-Rezeptoren vermittelt werden. Im Zuge der geschilderten Untersuchungen konnte ferner belegt werden, dass unter speziellen Voraussetzungen, nämlich nach längerer (6-stündiger) Prä-Inkubation mit Melatonin, dieses Hormon auch stimulierende Effekte auf die Insulinsekretion entwickeln kann. Vergleichbare Effekt sind von Untersuchungen anderer Zelltypen bekannt und wurden als "Sensitivierungseffekt des Rezeptors" erklärt.

8. Künftige Zielstellungen
Abschließend sei festgestellt, dass die bisherigen Ergebnisse eine sehr erfolgversprechende Grundlage für bereits begonnene und weiterführende Untersuchungen darstellen. Dazu gehört die Klärung der Frage, ob und in welcher Weise Uhrengene die circadian-rhythmische Insulinsekretion steuern. Die Kenntnis dieses Sachverhaltes, eingeschlossen die Möglichkeit, Einfluss auf die Insulinsekretion zu nehmen, wäre von erheblicher klinischer Bedeutung. Ferner soll nach intensiver Untersuchung von Melatonin-Rezeptoren auf der pankreatischen α- sowie β-Zelle untersucht werden, ob es direkte Rezeptor-mediierte Einflüsse von Melatonin auch auf die Somatostatin-sezernierende pankreatische D-Zelle gibt. Schließlich sollen in Kooperation mit anderen Gruppen Stammzelluntersuchungen an etablierten humanen Stammzelllinien den Abschluss der Projektarbeiten darstellen, mit deren Hilfe erste Aussagen zur Ontogenese von Melatoninrezeptoren in der pankreatischen Insel und seiner unterschiedlichen Zellarten getroffen werden könnten.

Literaturangaben: Siehe Publikationen
Aktualisiert: März 2012, verantwortlich: E. Peschke